Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ (gossypium arboreum l ) phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn

c tin hành da trên m biu hin bnh xanh
lùn theo 4 cp cc ghi nh
+ Cp 0: Không nhim bnh
+ C bin dng nh
+ Cm và b bin dng d nhn thy
+ Cp 3: Lá có màu xanh nht, b bin dng nhiu và gân lá vàng
m kháng/nhim: Cây có bnh c
bnh 1-m.
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học của các giống bông
 c tính nông sinh hc ca các ging bông c da trên 3
nhóm ch tiêu chính:
(1) Nhóm ch tiêu v ng: Thời gian sinh trưởng (ngày); Chiều cao cây (cm); Số
cành đực/cây; Số cành quả/cây; Vị trí cành quả 1 (đốt).
(2) Nhóm ch tiêu v t và các yu t ct: Khối lượng quả (g); Số
quả/cây; Năng suất lý thuyết (tạ/ha); Khối lượng 100 hạt (g); Tỷ lệ xơ (%); Năng suất
bông hạt (tạ/ha); Năng suất bông xơ (tạ/ha).
(3) Nhóm ch tiêu v ht, t l : Chiều dài xơ (mm); Độ đều xơ (%);
Độ mịn xơ (mix); Độ chín xơ (%); Độ bền xơ (g/tex).
S liu theo dõi v các ch c tính nông sinh hc các ging
c nhp vào phn mm thng kê IRRISTAT v.4.0 (IRRI, 1998)  x lý.
2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số và quy trình chạy phản ứng PCR
a) Tách chit ADN tng s
ADN c tách chit và tinh sa Doyle,
J.J. và cs. (1987).
Quy trình tách chit ADN tng s:
- Mc nghin mng trong ng eppendorf 2ml
- Thêm 1ml dung dm chit
-  65  C trong 90 phút, c 15 phút lu mt ln.
- Cho 500µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lc nh 
tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.
- Chuyn phn dch phía trên sang ng eppendorf m
t thu kt ta.
- Ra kt ta b
 thu ta.
- Tip tc ra b
 thu ta.
-  
- Kh ARN bng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong t m 370C trong 3h.
Kim tra ADN tng s: Chng và n ADN tng s c kim tra trên
gel agarose 0.8%. N  Nanodrop.
b) K thut PCR
Phn   c tin hành trên máy chu k nhit Veriti 96well Thermal
cycler. Tng dung dch phn ng là 15 µl bao gm 50ng ADN tng s, 0.15µM mi, 0.2
mM dNTPs, 1X d Taq TaKaRa.
Bảng 2.1. Chƣơng trình chạy phản ứng PCR
Các bƣớc
Nhit độ (
o
C)
Thời gian
Số chu kỳ
Tác dụng
1
95
7 phút
1
Bin tính
2
94
55
15 giây
30 giây
40
Bin tính
Gn mi
72
2 phút
Tng hp
3
72
7 phút
1
Tng hp
4
4


Bo qun
2.2.3.2. Phân tích số liệu đa hình di truyền




 , 

 , 
allen cá bit,  (Polymorphism Information Content ) 









ng
 (1)  %
 










. (2) Allen cá bi




















1 







 . (3) 




  (Botstein,1980)  






:

n s xut hin ca alen th ng vi mi i.
Giá tr PIC càng ln tc là m a locus do mi i khui càng ln,
tc là càng nhic sinh ra.
- H s ng di truyn S: phn ánh m ging nhau và khác nhau gia
các gi  tính toán h s 
2
xy
xy
N
S
NN



S là h s ng; Nxy: là s  trí ca mu x và y; Nx,
Ny: là s a mu x và y.
- Khong cách di truyn d: d = 1 – S

























 , trong 
cùng mt v trí. 



 -




 . , 












 










UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages)
Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

30 ging bông c nhp nc tring rung
ti Vin Nghiên cu Bông và PTNN Nha H i ca
Vin (hình 3.1b). Mu lá non ca tng ging bông riêng bic thu thp
m ca B môn Sinh hc phân t, Vin Di truyn Nông nghip
 tách chit ADN tng s, phc v phân tích ch th phân t ng di truyn.

Hình 3.1. Gieo trồng ngoài đồng (a) để duy trì và trong nhà lƣới (b,c) để lấy mẫu lá.
3.1. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ (G.arboreum L.)
Kt qu nghiên cu cho thy, trong 30 ging bông c nh,
ging bông c Ngh An là ging duy nht có biu hin kháng vi bnh xanh lùn, các
ging còn lu có biu hin nhim bnh.
 n hành chi vi tính kháng bnh xanh lùn trên ging bông
c Ngh An, kt qu n lc 6 dòng biu hin tính kháng b
-00-02, KXL-00-03, KXL-00-04, KXL-00-05
(bng 3.1). Nh làm vt li lai vi các dòng ging
bông vi khác, to qun th con lai lp b gen kháng bnh xanh lùn.
a
b
c
Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc các dòng kháng bnh xanh lùn của bông Ngh An.
TT
Dòng
Tổng số
cây
Tỷ l bnh
(%)
Thời gian ủ bnh
trung bình (ngày)
1
KXL-00-01
23
4,3
25,0
2
KXL-00-02
32
0
0
3
KXL-00-03
29
0
0
4
KXL-00-04
22
0
0
5
KXL-00-05
22
0
0
6
KXL-00-06
27
3,7
30,0
3.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ
NGHIÊN CỨU
c tính nông sinh hc t 30 ging bông nghiên cu trê tài
c 14 ging mang nht nht da trên các ch tiêu chính
v     /ha) và ch     bn-g/tex). Nhng ging có
phm cht tc trình bày  bng 3.2 
Bảng 3.2. Một số giống bông cỏ tiềm năng đạt năng suất cao và chất lƣợng tốt
TT
MS
TĐ
Tên giống
Thời gian
sinh trƣởng
(ngày)
Năng suất
bông xơ
(tạ/ha)
Độ bền
(g/tex)
1
7
C Bc Ái
97,0
4,9
17,6
2
15
AK-235
100,0
5,7
20,6
3
18
C Lc Ngn
97,0
4,0
18,1
4
42
Akola
103,0
6,2
21,1
5
43
Tka 283
104,0
5,9
20,0
6
44
Tka188
102,0
5,3
19,2
7
46
Ava
99,0
5,6
19,6
8
75
B10
107,0
8,0
17,5
9
77
91-B-16
107,0
11,3
17,5
10
79
BAA(bar x arb)
107,0
4,3
20,5
11
80
BAA(bar x arb)
106,0
7,4
18,5
12
82
BAA(bar x arb)
106,0
5,9
17,5
13
86
BAA(bar x arb)
99,0
4,0
21,1
14
101
Không tên
106,0
5,1
22,8
Max
107,0
11,3
22,8
Min
97,0
4,0
17,5
Trung bình
102,9
5,9
19,4

14 ging bông c có tit cao và chng tt trên s  cho
vic chn ra các ging b/m  lai vi các dòng kháng bnh to qun th F1
phc v cho vic lp b gen kháng bnh xanh lùn trên cây bông.

3.3. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN CỨU
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR
3.3.1. Tách chiết ADN tổng số của các giống bông phục vụ phân tích SSR
Mu lá non ca 30 ging bông c và 1 dòng bông kháng (KXL-00-02) sau khi
c tách chit ADN tng s c n khá cao, t
200  1.500ng/µl.



Hình 3.2. Kết quả kiểm tra ADN của các giống bông trên gel agarose 0,8%
Giếng số 1-31: ADN các giống bông nghiên cứu
Giếng ngoài cùng bên phải:  ADN chuẩn với nồng độ 100ng

3.3.2. Kết quả phân tích đa hình ADN các giống bông bố mẹ bằng chỉ thị SSR
ADN tng s ca 30 ging và 1 dòng bông c kháng bnh xanh lùn sau khi tinh
sc s d  tin hành làm phn ng PCR vi 50 ch th phân t SSR. Tuy
i vi h gen bông, vic nh
y, trong s 50 cp mi nm ri rác trên h 
nghiên cu, ch có 15 cp mi cho kt qu m 30% tng s cp mi. S 
a các gin phm m hoc không cho sn
phm PCR, nên b loi b khi nghiên cu. Hình 3.3 và 3.4 là nh gel minh h
ADN gia các ging bông c khi kho sát vi mt s cp mi SSR. Kt qu cho thy cp
mi rõ gia các ging bông.



Hình 3.3. Sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với các cặp mồi nhóm
BNL trên gel agarose 3%
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 2-32: Sản phẩm PCR các giống bông
(đánh số theo tên mã số tập đoàn)



Hình 3.4. Sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với một số cặp mồi nhóm NAU, TM và
STV trên gel agarose 3%
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 2-32: Sản phẩm PCR các giống bông
(đánh số theo tên mã số tập đoàn)

S liu phân tích kin m  tiêu
ng chính, kt qu c tng hp  bng 3.3.
Bảng 3.3. Các chỉ tiêu về alen, chỉ số đa dạng PIC của các locus SSR nhận biết trên
31 giống bông nghiên cứu

Chỉ thị
NST
Số
Kích thƣớc
Tần số
Số
PIC
TT
SSR
allen
sản phẩm
PCR (bp)
allen phổ
biến nhất
allen
cá bit
1
BNL1408
AD05,AD11
4
140-200
41,304
0
0,674
2
BNL1673
A12,AD12,AD22
2
135-150
64,516
0
0,458
3
BNL1679
A12,AD12
3
135-149
50,000
1
0,531
4
BNL2656
AD19
2
145-160
72,500
0
0,399
5
BNL2921
AD01
3
145-165
86,667
1
0,238
6
BNL2960
AD10
2
140-148
86,667
0
0,231
7
BNL3259
AD02,AD08,AD30
2
150-160
51,667
0
0,499
8
BNL3261
A12,AD12
2
145-152
66,667
0
0,444
9
BNL3284
AD11
2
130-135
83,871
0
0,271
10
BNL3478
AD13,AD18
2
150-157
79,310
0
0,328
11
BNL4053
AD09,AD23
2
150-175
83,333
0
0,278
12
NAU5074
A_chr08
2
225-250
56,098
0
0,493
13
STV002
A_chr05
2
120-130
61,290
0
0,475
14
TMD03
AD_chr01
2
210-230
55,172
0
0,495
15
TME20
AD_chr19
2
145-155
72,973
0
0,394
Tổng số
34


2

Trung bình
2,3

67,469
0,13
0,414
Min
2

41,304
0
0,231
Max
4

86,667
1
0,674
 tài n hành so sánh kt qu c trong nghiên cu này vi các kt qu
v ng di truyc công b c. Kt
qu c th hin  bng 3.4.
Bảng 3.4. Một số kết quả phân tích đa dạng SSR ở cây bông đã đƣợc công bố
TT
Tác giả
Sô
́

giô
́
ng
Sô
́

chỉ
thị
Tô
̉
ng
sô
́
allen
Trung bình
Sô
́

allen
PIC

1
Rehman và cs. (2009)
33
25
50
2,00
0,39
2
Khan và cs. (2009)
40
34
74
2,17
-
3
Boopathi và cs. (2008)
35
88
151
1,72
0,37
4
Dongre và cs. (2007)
19
17
30
1,76
0,38
5
Guang và cs. (2006)
43
36
130
3,60
0,62
6
Wangzhen Guo (2006)
109
60
128
2,18
-
7
Liu và cs. (2006)
39
74
165
2,23
0.41
8
Bertini và cs. (2006)
53
31
66
2,13
0,40
9
Nguyt và cs. (2009)
49
50
128
2,56
-
10
Nghiên cƣ
́
u na
̀
y
30
15
34
2,3
0,41

Kt qu phân tích cho thy s allen trung bình trong nghiên cu c là khá
cao, là 2,3; trong khi hu ht các nghiên cu còn lu có s c
i 2,2 (Rehman và cs, 2009; Khan và cs, 2009; Boopathi và cs, 2008; Dongre và cs,
2007; Wangzhen Guo, 2006; Liu và cs, 2006; Bertini và cs, 2006). Khi so sánh v ch s
ng PIC gia các nghiên cu, chúng tôi nhn thy ch s ng PIC ca nghiên cu
 trung bình khá cao, 0,41, trong khi các nghiên c có giá tr
 nm trong khong t n 0,41, duy ch có công trình ca Guang và cs.
c giá tr PIC trung bình cao nht là 0,62.



. 

















 






 c s dng nhng ch th này s có
n cây bông.
3.3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống bông nghiên cứu.
S liu phân tích SSR vi các ging bông tip t lý bng phn
m phân tích m ng di truyn và khong cách di truyn
gia các ging bông nghiên cu. Kt qu c  bng 3.5 và hình 3.5.

Xem chi tiết: Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ (gossypium arboreum l ) phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn